Un filtro a fluorescenza è un componente essenziale nel microscopio a fluorescenza. Un tipico sistema ha tre filtri base: un filtro di eccitazione, un filtro di emissione e uno specchio dicroico. Sono comunemente confezionati in un cubo in modo che il gruppo venga inserito insieme nel microscopio.
Come funziona un filtro per fluorescenza?
Filtro di eccitazione
I filtri di eccitazione trasmettono la luce di una lunghezza d'onda specifica e bloccano altre lunghezze d'onda. Possono essere utilizzati per produrre colori diversi regolando il filtro per consentire il passaggio di un solo colore. I filtri di eccitazione sono disponibili in due tipi principali: filtri passa lungo e filtri passa banda. L'eccitatore è solitamente un filtro passa-banda che lascia passare solo le lunghezze d'onda assorbite dal fluoroforo, riducendo così al minimo l'eccitazione di altre sorgenti di fluorescenza e bloccando la luce di eccitazione nella banda di emissione della fluorescenza. Come mostrato dalla linea blu nella figura, la BP è 460-495, il che significa che può passare solo attraverso la fluorescenza di 460-495 nm.
Viene posizionato all'interno del percorso di illuminazione di un microscopio a fluorescenza e filtra tutte le lunghezze d'onda della sorgente luminosa ad eccezione dell'intervallo di eccitazione del fluoroforo. La trasmissione minima del filtro determina la luminosità e la brillantezza delle immagini. Si consiglia una trasmissione minima del 40% per qualsiasi filtro di eccitazione in modo che la trasmissione sia idealmente >85%. La larghezza di banda del filtro di eccitazione deve essere interamente compresa nell'intervallo di eccitazione del fluoroforo in modo tale che la lunghezza d'onda centrale (CWL) del filtro sia il più vicino possibile alla lunghezza d'onda di picco di eccitazione del fluoroforo. La densità ottica (OD) del filtro di eccitazione determina l'oscurità dell'immagine di sfondo; L'OD è una misura della capacità di un filtro di bloccare le lunghezze d'onda al di fuori del raggio di trasmissione o della larghezza di banda. Si consiglia un OD minimo di 3,0, ma l'ideale è un OD pari o superiore a 6,0.
Filtro delle emissioni
I filtri di emissione hanno lo scopo di consentire alla fluorescenza desiderata dal campione di raggiungere il rilevatore. Bloccano le lunghezze d'onda più corte e hanno un'elevata trasmissione per lunghezze d'onda più lunghe. Al tipo di filtro è anche associato un numero, ad esempio BA510IF nella figura (filtro barriera antidisturbo), tale designazione si riferisce alla lunghezza d'onda al 50% della sua massima trasmissione.
Le stesse raccomandazioni per i filtri di eccitazione valgono per i filtri di emissione: trasmissione minima, larghezza di banda, OD e CWL. Un filtro di emissione con la combinazione CWL ideale, trasmissione minima e OD fornisce le immagini più luminose possibili, con il blocco più profondo possibile e garantisce il rilevamento dei segnali di emissione più deboli.
Specchio dicroico
Lo specchio dicroico è posto tra il filtro di eccitazione e il filtro di emissione con un angolo di 45° e riflette il segnale di eccitazione verso il fluoroforo mentre trasmette il segnale di emissione verso il rivelatore. I filtri dicroici e i divisori di fascio ideali hanno transizioni nette tra la massima riflessione e la massima trasmissione, con una riflessione >95% per la larghezza di banda del filtro di eccitazione e una trasmissione >90% per la larghezza di banda del filtro di emissione. Selezionare il filtro tenendo presente la lunghezza d'onda di intersezione (λ) del fluoroforo, per ridurre al minimo la luce diffusa e massimizzare il rapporto segnale-rumore dell'immagine fluorescente.
Lo specchio dicroico in questa figura è il DM505, così chiamato perché 505 nanometri è la lunghezza d'onda al 50% della trasmissione massima per questo specchio. La curva di trasmissione per questo specchio mostra un'elevata trasmissione al di sopra di 505 nm, un forte calo nella trasmissione a sinistra di 505 nanometri e una riflettività massima a sinistra di 505 nanometri, ma potrebbe comunque avere una certa trasmissione al di sotto di 505 nm.
Qual è la differenza tra filtri passa lungo e passa banda?
I filtri per fluorescenza possono essere suddivisi in due tipi: passa lungo (LP) e passa banda (BP).
I filtri passa lungo trasmettono lunghezze d'onda lunghe e bloccano quelle più corte. La lunghezza d'onda di taglio è il valore al 50% del picco di trasmissione e tutte le lunghezze d'onda al di sopra del taglio vengono trasmesse dai filtri passa lungo. Sono spesso utilizzati negli specchi dicroici e nei filtri di emissione. I filtri passa lungo dovrebbero essere utilizzati quando l'applicazione richiede la raccolta della massima emissione e quando la discriminazione spettrale non è desiderabile o necessaria, come generalmente avviene per le sonde che generano una singola specie emittente in campioni con livelli relativamente bassi di autofluorescenza di fondo.
I filtri passa banda trasmettono solo una determinata banda di lunghezze d'onda e ne bloccano altre. Riducono la diafonia consentendo la trasmissione solo della porzione più forte dello spettro di emissione del fluoroforo, riducono il rumore dell'autofluorescenza e quindi migliorano il rapporto segnale/rumore nei campioni di autofluorescenza di fondo elevato, che i filtri passa lungo non possono offrire.
Quanti tipi di set di filtri per fluorescenza può fornire BestScope?
Alcuni tipi comuni di filtri includono i filtri blu, verdi e ultravioletti. Come mostrato nella tabella.
| Insieme di filtri | Filtro di eccitazione | Specchio dicroico | Filtro barriera | Lampada a LED Lunghezza d'onda | Applicazione |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: metodo con anticorpi fluorescenti ·Arancio acido: DNA, RNA ·Auramina: bacillo tubercolare ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rodamina, TRITC: metodo con anticorpi fluorescenti ·Ioduro di propidio: DNA ·Richiesta di offerta |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | ·Osservazione dell'autofluorescenza ·DAPI: colorazione del DNA ·Hoechest 332528, 33342: utilizzato per la colorazione dei cromosomi |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | ·Catecolamine ·5-idrossitriptamina ·Tetraciclina: Scheletro, Denti |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
I set di filtri utilizzati nelle acquisizioni in fluorescenza sono progettati attorno alle principali lunghezze d'onda utilizzate nelle applicazioni di fluorescenza, che si basano sui fluorofori più utilizzati. Per questo motivo prendono il nome anche dal fluoroforo a cui sono destinati per l'imaging, come i cubi filtro DAPI (blu), FITC (verde) o TRITC (rosso).
| Insieme di filtri | Filtro di eccitazione | Specchio dicroico | Filtro barriera | Lampada a LED Lunghezza d'onda |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramina | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Rosso texano | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Come si sceglie un filtro per fluorescenza?
1. Il principio di selezione del filtro per fluorescenza è quello di lasciare che la luce di fluorescenza/emissione passi il più lontano possibile attraverso l'estremità dell'immagine e allo stesso tempo bloccare completamente la luce di eccitazione, in modo da ottenere il rapporto segnale-rumore più elevato. Soprattutto per l'applicazione dell'eccitazione multifotone e del microscopio a riflessione interna totale, il rumore debole causerà anche una grande interferenza con l'effetto immagine, quindi il requisito del rapporto segnale/rumore è più elevato.
2. Conoscere lo spettro di eccitazione e di emissione del fluoroforo. Per costruire un set di filtri per fluorescenza che generi un'immagine di alta qualità e ad alto contrasto con uno sfondo nero, i filtri di eccitazione ed emissione dovrebbero raggiungere un'elevata trasmissione con un'ondulazione minima della banda passante sulle regioni che corrispondono ai picchi di eccitazione o alle emissioni del fluoroforo.
3. Considerare la durata dei filtri per fluorescenza. Questi filtri devono essere impermeabili alle sorgenti luminose intense che generano luce ultravioletta (UV) che potrebbe portare al "burnout", in particolare del filtro eccitatore poiché è soggetto alla piena intensità della sorgente di illuminazione.
Le diverse immagini campione fluorescenti
Le risorse vengono raccolte e organizzate su Internet e vengono utilizzate solo per l'apprendimento e la comunicazione. In caso di violazione, contattaci per eliminarla.
Orario di pubblicazione: 09-dic-2022