Un microscopio a fluorescenza è un tipo di microscopio ottico che utilizza una sorgente luminosa ad alta intensità per illuminare il campione ed eccitare i fluorocromi nel campione. L'illuminazione del campione viene solitamente effettuata con una sorgente luminosa che emette luce ultravioletta. Sono ampiamente utilizzati in campo biologico, medico e industriale.
Come funziona un microscopio a fluorescenza?
Un microscopio a fluorescenza utilizza una lampada al mercurio o allo xeno per produrre luce ultravioletta. La luce entra nel microscopio e colpisce uno specchio dicroico, uno specchio che riflette una gamma di lunghezze d'onda e consente il passaggio di un'altra gamma. Lo specchio dicroico riflette la luce ultravioletta fino al campione. Alcuni campioni emettono fluorescenza naturalmente alla luce ultravioletta perché contengono sostanze fluorescenti come la clorofilla. Se il campione da visualizzare non presenta fluorescenza naturale, può essere colorato con coloranti fluorescenti chiamati fluorocromi.
In cosa consiste un microscopio a fluorescenza?
1. Sorgente luminosa
Le sorgenti luminose più comuni sono il mercurio, lo xeno e i LED. Il mercurio fornisce la migliore qualità di luce per il microscopio a fluorescenza. I LED stanno diventando più popolari perché sono meno costosi di altre fonti e consumano meno energia.
| Lampada al mercurio | Lampada allo xeno | GUIDATO | |
| Lunghezza d'onda della luce emessa | 350-370 nm | 400nm～ 450nm | 400-700 nm |
| Durata (ora) | 200-300 | 400-600 | 10000 |
| Vantaggio | 1. Luce ad alta intensità, le sorgenti luminose più comuni. 2. Emette forti raggi ultravioletti e blu-viola per eccitare tutti i tipi di fluorofori. 3. Immagini luminose e colorate. | 1. L'intensità spettrale è stabile. 2. Forte intensità spettrale nell'infrarosso e nel medio infrarosso. | 1. Facile da sostituire. 2. Non è necessario riscaldarsi. 3. Può essere acceso e spento istantaneamente. 4. Controlla l'intensità della sorgente luminosa. |
| Svantaggio | 1. Una vita breve. 2. Tempo di riscaldamento lungo. | 1. Per il calore in eccesso è necessaria una speciale scatola di alimentazione CC a bassa tensione. 2. Più costoso della lampada al mercurio | 1. La luce UV è più debole della lampada al mercurio. 2.Ogni lunghezza d'onda della luce richiede un LED separato a causa della larghezza di banda ridotta che emettono. |
Attacco fluorescente al mercurio
Attacco LED fluorescente
2. Filtro di eccitazione
Il filtro di eccitazione è essenziale per il funzionamento di un microscopio a fluorescenza. Passa la luce con una lunghezza d'onda più corta, che il colorante fluorescente potrebbe assorbire. Inoltre, blocca le altre fonti di luce eccitante.
Filtro di eccitazione (B,G,U,V)
3. Specchio dicroico
Lo specchio dicroico è un tipo di filtro ottico che riflette la luce a determinate lunghezze d'onda mentre ne trasmette altre. Viene utilizzato nei microscopi a fluorescenza per separare le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione.
4. Filtro delle emissioni
Il filtro di emissione lascia passare solo le lunghezze d'onda emesse dal fluoroforo e blocca tutta la luce indesiderata al di fuori di questa banda, in particolare le lunghezze d'onda di eccitazione.
5. Coloranti fluorescenti
I coloranti fluorescenti sono composti organici che possiedono la proprietà della fluorescenza, grazie alla quale possono formare un'immagine fluorescente emettendo luce verde visibile ad alto contrasto dopo essere stati eccitati dalla luce ultravioletta altamente illuminante. I coloranti fluorescenti comunemente usati sono; DAPI (49,6-diamidino-2-fenilindolo), arancio di acridina, auramina-rodamina, Alexa Fluors o DyLight 488.
Quanti tipi di microscopi a fluorescenza?
1. Microscopio verticale a epifluorescenza:
È il tipo più comune di microscopio a fluorescenza. L'eccitazione del fluoroforo e la rilevazione della fluorescenza avvengono attraverso lo stesso percorso luminoso (cioè attraverso l'obiettivo). La maggior parte dei microscopi a fluorescenza, soprattutto quelli utilizzati nelle scienze della vita, sono del tipo a epifluorescenza.
Microscopio biologico fluorescente da ricerca BS-2081F
2. Microscopio a fluorescenza confocale:
Microscopio confocale a fluorescenza: questo tipo di microscopio a fluorescenza combina la scansione laser con l'illuminazione fluorescente per produrre un'immagine. Può essere utilizzato in un'ampia gamma di applicazioni, come lo studio di cellule e tessuti, il rilevamento di proteine e altre sostanze all'interno delle cellule e la misurazione dello spessore dei materiali.
Microscopio biologico fluorescente da ricerca BS-2081F
3. Microscopio a fluorescenza invertito
La sorgente luminosa e il condensatore di questo tipo di microscopio si trovano in alto, rivolti verso il basso. L'angolo di illuminazione deve essere di 90 gradi rispetto alla superficie del campione in esame.
Microscopio fluorescente invertito BS-2095F
Quali sono i vantaggi e gli svantaggi dei microscopi a fluorescenza?
Vantaggi:
- Permette l'osservazione delle cellule negli organismi viventi senza danneggiarle
- Fornisce immagini ad alta risoluzione con colori accurati
- Permette lo studio dei processi vivi nelle cellule
- Essere utilizzato per identificare diversi tipi di molecole all'interno delle cellule, come proteine o acidi nucleici.
Svantaggi:
-Permette solo l'osservazione di strutture specifiche all'interno di una cellula marcata con il colorante fluorescente.
-Il fotosbiancamento dovuto all'eccitazione degli elettroni durante il processo di fluorescenza può influenzare le molecole reattive dei coloranti fluorescenti. Di conseguenza, i coloranti reattivi potrebbero perdere la loro proprietà chimica di intensità dell'emissione di fluorescenza.
-Le cellule sono suscettibili all'effetto fototossico dopo la colorazione con coloranti fluorescenti, poiché le molecole di fluoroforo assorbono i fotoni ad alta energia dalla luce a lunghezza d'onda corta.
Quali sono le applicazioni di un microscopio a fluorescenza?
I microscopi a fluorescenza sono ampiamente utilizzati in vari campi di ricerca e applicazione tra cui biochimica, biologia cellulare, microbiologia, immunologia e medicina.
1. Nel campo della biologia, il microscopio a fluorescenza consente l'identificazione accurata e dettagliata di componenti e attività cellulari cellulari e submicroscopiche con l'aiuto della marcatura con coloranti fluorescenti.
2. In campo medico, il microscopio a fluorescenza può utilizzare reagenti fluorescenti per rilevare la presenza e la distribuzione di batteri e virus o per assistere nell'etichettatura di bersagli chirurgici per facilitare l'intervento chirurgico.
3. Nel campo della mineralogia, il microscopio a fluorescenza viene spesso utilizzato per studiare sostanze con proprietà di fluorescenza spontanea, come asfalto, petrolio, carbone, ossido di grafene e altri minerali.
4. Nella scienza dei materiali, il microscopio a fluorescenza può essere utilizzato nell'industria tessile o nell'industria della carta per analizzare materiali a base di fibre.
Orario di pubblicazione: 14 marzo 2023